DH5α-m Electrocompetent Cell

大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

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菌株描述

DH5α-m是兼容DH5α和DH10B菌株優(yōu)點(diǎn)的一款克隆菌株，在其基因組中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突變，使得從外源攝入的甲基化DNA不被降解，從而利于甲基化DNA的克隆和擴(kuò)繁，特別適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA，同時(shí)提高了電轉(zhuǎn)效率。recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。lacZΔM15的存在使其可用于藍(lán)、白斑篩選。

DH5α-m菌株基因型：F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA mcrA Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC)

產(chǎn)品描述

本品是大腸桿菌DH5α-m菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的電擊感受態(tài)細(xì)胞，只能用于DNA的電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞2×10¹⁰ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個(gè)月有效。其中，組分C（S.O.C. Medium）+4℃保存。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）   感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，不可反復(fù)凍融和放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2）   整個(gè)轉(zhuǎn)化操作，嚴(yán)格根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件要求進(jìn)行。

3）   加入DNA的體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。DNA不純或存在鹽、乙醇、蛋白及緩沖液等污染時(shí)，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

4）   為確保最高轉(zhuǎn)化效率，整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)盡量輕柔，并保持低溫。

5）   電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

6）   電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

7）   若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

8）   對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：最好在轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液重懸產(chǎn)物，保證DNA濃度不超過(guò)100ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

9）   混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)不可用孔徑過(guò)小的槍頭（普通200μl槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm）。避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

10）  為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

【準(zhǔn)備工作】：根據(jù)每管（50μl）電擊感受態(tài)需10ml S.O.C.培養(yǎng)基的比例，提前將適量的S.O.C.培養(yǎng)基置于37℃預(yù)熱1-2h。

1）將0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發(fā)干凈，立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2）取-80℃保存的電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min，待其完quan融化。加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物），用手bo打管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

【注意】：要測(cè)定轉(zhuǎn)化效率，請(qǐng)使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：對(duì)于連接產(chǎn)物，部分公司的T4連接酶體系或重組體系不用純化，可直接與電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，需控制DNA濃度≤100ng/μl，體積≤5μl/50μl感受態(tài)細(xì)胞。

【注意】：對(duì)鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系需用膜純化或乙醇沉淀DNA后加入適量ddH2O重懸，然后與電擊感受態(tài)細(xì)胞混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，需控制DNA濃度≤100ng/μl，體積≤5μl/50μl感受態(tài)細(xì)胞。

3）用200μl槍頭（注意所用的槍頭用剪刀剪掉0.5cm尖頭）輕輕吹打混勻感受態(tài)細(xì)胞-DNA之后快速轉(zhuǎn)移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，輕輕晃動(dòng)使液面保持水平狀態(tài)，蓋上杯蓋，插入冰中。

4）啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此參數(shù)參考Bio-rad，具體使用請(qǐng)參考電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)來(lái)操作），將電擊杯從冰中拿出，用吸水紙擦拭表面，吸干表面水漬，放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成后，拿出電轉(zhuǎn)杯放室溫。

5）打開(kāi)杯蓋，15s內(nèi)加入900 μl無(wú)抗生素的無(wú)菌S.O.C.培養(yǎng)基（已預(yù)熱），用1ml槍吹吸電擊杯底部2-3次，混勻后轉(zhuǎn)移到50ml離心管，向離心管內(nèi)補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基定容至10ml。于37℃，225rpm振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)1h。

6）5,000rpm離心1min收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C.平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑150mm培養(yǎng)皿2~5個(gè)），用無(wú)菌玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)13~17h。

【注意】：后續(xù)若想獲得大量高純度質(zhì)粒，建議在TB培養(yǎng)基中于37℃搖菌培養(yǎng)，以對(duì)照質(zhì)粒pUC19為為例，在TB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的菌體濃度和質(zhì)粒產(chǎn)量，約是LB培養(yǎng)基的3-4倍，約是SOB培養(yǎng)基的2倍。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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