Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（顯色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

本總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用兩步法測(cè)定總一氧化氮水平，一步先用硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，第二步再用經(jīng)典的Griess reagent，對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行定量測(cè)定，從而推算出總一氧化氮含量。

由于本試劑盒使用的是NADPH依賴的硝酸鹽還原酶，高濃度的NADPH會(huì)干擾后續(xù)檢測(cè)，因此，試劑盒使用乳酸脫氫酶（LDH）來(lái)清除NADPH，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試劑盒以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)優(yōu)化的檢測(cè)體系，檢測(cè)下限達(dá)2μM，且在2~80μM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本試劑盒不僅能檢測(cè)細(xì)胞、組織或培養(yǎng)液中的一氧化氮含量，還能檢測(cè)血清、血漿或尿液中的一氧化氮含量。

• 當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞或組織一氧化氮含量，不建議使用RIPA裂解液，因其可能在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生沉淀，影響測(cè)試。建議使用一氧化氮分析用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制劑）（貨號(hào)：MP1509-100ML）。也可自行選擇適當(dāng)方式制備組織或細(xì)胞樣品的裂解液，要考慮到自行選擇的方式是否存在干擾試劑盒內(nèi)酶反應(yīng)的可能。
• 當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)一氧化氮含量，不可使用RPMI1640等含較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液，否則會(huì)干擾檢測(cè)。
• 所有檢測(cè)反應(yīng)需避光進(jìn)行。
• 由于檢測(cè)過(guò)程存在還原反應(yīng)，凡是影響還原反應(yīng)的試劑都需要避免，比如DTT或2-ME。
• 本試劑盒利用的是間接法測(cè)定總一氧化氮含量，如果只需粗略測(cè)定一氧化氮相對(duì)量，可選擇我司提供的一氧化氮檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：MX4731-500T）。如果需要直接測(cè)定一氧化氮水平，比如測(cè)定細(xì)胞內(nèi)實(shí)際的一氧化氮水平，可選擇我司提供的DAF-FM DA一氧化氮熒光探針（貨號(hào)：MX4702-100T）。
• 本試劑盒對(duì)人體有害，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)，避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
• 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

【注意事項(xiàng)】

• 反應(yīng)必須避光進(jìn)行。當(dāng)使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，可用鋁箔紙包裹96孔板進(jìn)行避光。
• 樣品的用量上限為60μl。血清、血漿或組織勻漿液通常使用40μl足夠。樣品不足60μl，不同樣品之間的體積需要保持一致，體積不足的部分用制備或稀釋樣品所用的溶液補(bǔ)足。
• 可同時(shí)設(shè)置加入200μl水或PBS的2~3個(gè)孔為陰性對(duì)照，這2~3個(gè)孔僅加入水或PBS，不在加入任何其他試劑。
• 加入Griess reagent I后需輕輕混勻。
• 每次混勻后，可以1000~3000g離心數(shù)秒，把液體沉淀至管底。同時(shí)需避免各檢測(cè)孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測(cè)結(jié)果。

3.2 在540nm（或520~560nm）測(cè)定吸光度。需在30min內(nèi)測(cè)完，以防褪色降低靈敏度。

3.3 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式。之后將樣品OD值代入公式來(lái)計(jì)總算一氧化氮濃度。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見右圖，僅供參考。實(shí)際測(cè)定時(shí)，由于反應(yīng)條件、試劑盒批次差異等因素，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與示例數(shù)據(jù)存在一定差異。

常見問(wèn)題

• 檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣品的吸光度很低，和空白對(duì)照接近，什么原因？

回復(fù)： 標(biāo)準(zhǔn)曲線良好說(shuō)明檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒基本上沒(méi)有問(wèn)題，樣品吸光度低說(shuō)明樣品中一氧化氮含量很低。可以采取的辦法是：1）加大樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的使用量至60μl，其余試劑用量不變。2）把整個(gè)檢測(cè)體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測(cè)靈敏度增加約50%。3）如果上述方法還不能解決問(wèn)題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時(shí)候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細(xì)胞時(shí)采用較小體積的裂解液），另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。

• 檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的吸光度都非常高，什么情況？

回復(fù)：使用RPMI 1640培養(yǎng)液時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況。因RPMI 1640培養(yǎng)液中含有高濃度的硝酸鹽從而會(huì)使樣品檢測(cè)出來(lái)的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會(huì)產(chǎn)生類似情況，影響氧化還原反應(yīng)的試劑也可能產(chǎn)生類似干擾。使用過(guò)程中避免使用RPMI 1640等可能導(dǎo)致干擾檢測(cè)的試劑即可。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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